Trabajos Originales
Martha F. Rodríguez, Pablo J. Patiño, Fernando Montoya, Diana García de Olarte
Dres. Martha F. Rodríguez, Pablo J. Patiño. Fernando Montoya. Diana García de Olarte: Laboratorio de Inmunología, Departamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. Medellín.
Objetivos: analizar el comportamiento in vitro de varias citoquinas relacionadas con la respuesta inmune en pacientes con SHIE, con asma alérgica y en sujetos normales.
Métodos: se analizó la respuesta proliferativa de las células mononucleares en respuesta a mitógeno y a antígenos específicos por medio de la incorporación de timidina tritiada. También se evaluó la producción de citoquinas por estas células después del estímulo in vitro con fítohemaglutinina (PHA) y tres antígenos diferentes a través de ELISA en los sobrenadantes y de slot-blot del AR N total.
Resultados: en los pacientes con SHIE se encontró un aumento significativo de producción del factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) en los cultivos de células mononucleares estimulados o no con nitrógeno o antígenos. No se encontraron alteraciones en la producción de IL-2, IFN-γ, IL-12p40, IL-4, IL-10 y TNF-α. De otro lado, en los pacientes asmáticos se evidenció un patrón de secreción de citoquinas TH2 cuando los cultivos fueron estimulados con PHA o con D. pteronyssinus. Además, los pacientes con SHIE presentaron disminución marcada de la respuesta linfoproliferativa cuando al estimular las células mononucleares con antígenos específicos, pero fue normal ante mitógenos.
Conclusiones: sugerimos que el aumento del GM-CSF en el SHIE puede ser un marcador de respuesta inflamatoria no regulada, debido a un defecto en la activación de células Τ específicas, que lleva a la persistencia del antígeno o al efecto de otros mediadores liberados de células inflamatorias en respuesta a la interacción de IgE y antígenos.
El SHIE es una inmunodeficiencia primaria que se inicia a eda d temprana , se caracteriza por niveles séricos de IgE muy elevados (mayores de 2000 UI/mL), alto porcentaje de IgE específica contra Staphylococcus aureus (aproximadamente 20% de la IgE total ) (1), infecciones sino pulmonares recurrentes, abscesos cutáneos fríos y eczema severo en piel y cuero cabelludo. Las infecciones son causadas principalmente por Staphylococcus aureus y Haemophilus influenzae tipo b. Aunque los niveles de IgE son muy altos, es de anotar que son muy raras las manifestaciones clínicas de atopia en estos pacientes (1-3). Además, presentan eosinofilia moderada en sangre y esputo (1), aumento de linfocitos Β y monocitos CD23+ (4) y alteraciones en la función de los polimorfonucleares (PMN) como un defecto variable en la quimiotaxis y un incremento en la actividad metabólica, sin alteración de la fagocitosis (5-7). En la inmunidad mediada por células Τ, los pacientes tienen defectos en la respuesta antígeno específica, tanto in vivo como in vitro, con una blastogénesis normal frente a mitógenos, subpoblaciones de linfocitos normales (1-3) y disminución del porcentaje de células Τ CD45RO, fenotipo de memoria (8).
Aunque los sobrenadantes de cultivos de linfocitos Τ de pacientes con SHIE inducen la síntesis de IgE en células Β alogénicas normales (9), no se han demostrado alteraciones en la producción de interleuquina 4 (L-4), IL-2 o interferon γ (IFN- γ) en cultivos de células mononucl e a r e s de sangre periférica (CMSP) de pacientes con SHIE estimulados con mitógenos; además, la adición de IFN-γ recombinante o de anticuerpos contra IL-4 o IL-6 no disminuyen significativamente la síntesis espontánea de IgE en estos cultivos (10). Otros investigadores han informado que el tratamiento con IFN-γ in vivo e in vitro reduce la síntesis espontánea de IgE y los niveles séricos de esta inmunoglobulina en un grupo de pacientes; sin embargo, no hubo diferencias entre la producción de IFN-γ por CMSP de los pacientes estimulados con PHA o concanavalina A y los controles (11). El análisis de clonas de células Τ de pacientes con SHIE ha mostrado una disminución de la proporción de linfocitos Τ capaces de producir IFN-γ y TNF- α en respuesta a PHA, sin alteración en la proporción de linfocitos Τ productores de IL-4 e IL-2 frente al mismo estímulo (12). Estos hallazgos han llevado a sugerir que estos pacientes tienen defectos en la activación y función de las subpoblaciones de los linfocitos Τ ayudadores (TH) (13, 14).
Con el fin de establecer si existe o no alguna anormalidad en la regulación de la respuesta inmune en los pacientes con SHIE, determinamos la producción de IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, IL-12, TNF-α y GM-CSF. Estas citoquinas influyen en la polarización de las subclases de linfocitos TH así: la IL-12 y el IFN-γ inducen la diferenciación hacia TH1, mientras que la IL-4 promueve la diferenciación a TH2 y la IL-10 regula negativamente la producción de IFN-γ y por lo tanto favorece el patrón TH2 (15,16). Además la IL-4 y el IFN-γ controlan positiva y negativamente la expresión de IgE (13,17). La IL-2, por su parte es el factor de crecimiento esencial para la generación de linfocitos TH efectores (16). Finalmente, el TNF-α y el GM-CSF son mediadores importantes de la inflamación y están involucrados en el daño tisular observado en los pacientes asmáticos (18). El GM-CSF estimula la eosinofilia in vivo y prolonga la supervivencia y función de los eosinófilos in vitro (19,20), incrementa la explosión respiratoria de los neutrófilos (21), aumenta su adherencia in vivo e in vitro (22), aumenta la liberación de histamina por los mastocitos (23) y la expresión de CD23 en monocitos (24), sugiriendo que esta última citoquina juega un papel relevante el la fisiopatología del SHIE.
Población de estudio
Se estudiaron dos pacientes con SHIE, diagnosticado de acuerdo con los criterios de Buckley (3). Incluimos nueve pacientes con asma alérgica (tres hombres y seis mujeres) sin tratamiento con drogas sistémicas y con prueba de hipersensibilidad inmediata positivas para D. pteronyssinus, esto con el objeto de comparar el patrón de citoquinas obtenido en nuestros pacientes con SHIE con el de sujetos asmáticos en quienes se ha descrito un patrón preferencial TH2, (25). Además se analizaron siete sujetos normales (cuatro hombres y tres mujeres) que no presentaban ningún tipo de patología, con pruebas de hipersensibilidad inmediata negativa para D. pteronyssinus. En el primer grupo se repitieron tres veces cada prueba. Todos los sujetos fueron vacunados con toxoide tetánico seis meses antes de iniciar los experimentos.
Cultivos de células mononucleares para el estudio de citoquinas
Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) fueron obtenidas a partir de sangre venosa anticoagulada con heparina mediante sedimentación de los glóbulos rojos con dextran 70 al 6% (Pharmacia, Uppsala, Sweden) y posterior centrifugación en un gradiente de histopaque (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) 15 min/400 xg/ temperatura ambiente (26). Luego, las células se lavaron tres veces con tampón fosfato salino (Dulbecco's PBS, Gibco- BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD). Finalmente, se cultivaron lxl07 células en 4 mL de RPMI1640 suplementado con 2 mM de Lglutamina (Sigma), 5.95 g/L de hepes (Sigma), 2 g/L de bicar bonato de sodio (Sigma), 10% de una mezcla de sueros humanos inactivada, 50 μg/mL de gentamicina y 100 U/mL de penicilina (Gibco-BRL), a 37°C/ 5% CO2, en condiciones de humedad. Las células fueron estimuladas o no, con 10 μg/mL de toxoide tetánico (Connaught Laboratories, Siwftwater, PA), 10 μg/ml de candidina (Miles, Elkhart, IN), 25 μg/mL de D. pteronyssinus (Miles) o 5 μg/ mL de PHA (Sigma). Después de 24 horas de incubación los sobrenadantes se colectaron y se guardaron a -70°C hasta su análisis. El botón celular se utilizó para la obtención del RNA.
Determinación de la linfoproliferación
En forma paralela a los cultivos anteriores, se cultivaron en microplatos de 96 pozos 1 x 105 células en 200 μl de RPMI-1640 suplementado y se estimularon con los mismos antígenos y mitógeno descritos arriba usando concentraciones iguales. Se cultivaron a 37°C/5% CO2 en condiciones de humedad. El tiempo de incubación fue establecido por curvas de calibración con CMSP de sujetos normales: nueve días para los cultivos con antígenos y cuatro días para los cultivos con PHA. Dieciocho horas antes de recolectar las células, se adicionaron 50 μl de timidina [3H] (Amershan, Little Chalfont, England) a una concentración de 10 μCi/mL en cada pozo. Las células se recolectaron sobre filtros de fibra de vidrio (Amershan) y se midió la radioactividad en un contador de centelleo Β (Beckman LS 3801, Columbia, MD). Los resultados se informaron como índices mitóticos (27).
Cuantificación de IL-2, IL-4, IL- 10 , IFN-γ, TNF-α y GM-CSF
La producción de citoquinas se determinó en los sobrenadantes de cultivos de CMSP estimuladas o no, de pacientes y sujetos normales utilizando los siguientes estuches comerciales de ELISA: IL-2 (sensibilidad: 8.7 pg/mL), IL-4 (< 2 pg/mL), IL-10(<5 pg/mL), IFN-γ (< 4 pg/mL), TNF-α (<I pg / mL) (BioSource, Camarillo, CA) y GMCS F ( 8 pg/mL ) (Immuno genetics, Zwijndrecht, Belgium).
Extracción de RNA total
Para extraer el RNA total se utilizó el reactivo Trizol (Gibco) de acuerdo con lo recomendado por el productor (28). Los botones de células se lisaron con 1 mL de Trizol por medio de pipeteo repetitivo, se agregaron 0.2 mL de cloroformo y se agitaron vigorosamente por 15 segundos, luego de lo cual el tubo se dejó reposar a temperatura ambiente durante dos a tres minutos. Estas muestras se centrifugaron a 12.000 xg/15 min/4°C y la fase acuosa e incolora se transfirió a un tubo nuevo. El RNA se incubó con isopropanol durante la noche a 4°C y se precipitó a 13.000 xg/15 min /4°C. Se permitió que se secara y se resuspendió en 50 μl de H20 tratada con DEPC. La concentración de RNA se determinó por espectrofometría en un Biochrom 4060 (PharmaciaLKB, Suecia).
Obtención de sondas
Las sondas de DNA humano utilizadas en este estudio fueron gentilmente cedidas por el Dr. Laurence Kedes (B-actina) del Institute for Genetics Medicine, University of Southern California, por los doctores Howard Young y Augusto Ochoa (L-4 e IFN-γ), del Biological Response Modifiers Program, National Cancer Institute y por Genetics Institute (Inc. (I1-12p40). Estas sondas de DNA se amplificaron en bacterias (29) y la purificación de los plásmidos se hizo por medio del estuche comercial Wizard Purificatio n System (Promega, Madison, WI). Los plásmidos se linearizaron con las enzimas de restricción correspondientes así: ß-actina: vector PBR, sitio de excisión BamHI, tamaño del inserto 2 Kb, IL-4: vector pCD, sitio de excisión Xhol, tamaño del inserto 0.8 Kb, IFN-γ: vector pUC9, sitio de excisión Ava I/HincII, tamaño del inserto ~1 Kb e IL-12 p40: vector pED (EMC), sitio de excisión XbaI. tamaño del inserto 2.3 Kb (New England BioLabs, Beverly, MA).
Slot blot de RNA e hibridación con las sondas de citoquinas
Las muestras de RNA se desnaturalizaron con 66% de formamida, 8% de formaldehído y 1.3 χ de MOPS a 68°C/15 min. Luego se depositaron sobre un filtro de nylon, Hybon Ν (Amersham) usando un dispensador de muestras (Gibco-BRL). El RNA desnaturalizado se secó a temperatura ambiente sobre un papel Whatman 3M y se fijó horneando durante 2h a 80°C (30). El RNA obtenido de los cultivos estimulados con PHA y toxoide tetánico se hibridó con las sondas de IL12p40 y ß-actina y se detectó por medio de quimioluminiscencia, usando el estuche ECL versión Π (Amersham). El RNA de cultivos estimulados o no con D. pteronyssinus se hibridó con las sondas de IL-4, IFN-γ y ß-actina marcadas con α32Ρ-ΑΤΡ (Amersham, actividad específica >108 dpm/μg) las cuales se marcaron por el método de random primers. Cada filtro se humedeció en SSC 6X, se colocó en una bolsa de hibridación, se adicionaron 20 mL de la solución de prehibridación (SSC 5X, Denhardt 5X, formamida 50%, SDS 1 % y 100 μg/mL de esperma de salmón desnaturalizado) y se incubó tres horas a 2°C a rotación continua. La sonda marcada se desnaturalizó por 10 min/100°C, se adicionó a la bolsa con la membrana y se hibridó toda la noche. Las filtros se lavaron dos veces con 2X SSC/SDS 0.1% por cinco min a temperatura ambiente, dos veces más con 0.1X SSC/ SDS 0.1% por 15 min/68°C y una última vez con 2X SSC a temperatura ambiente. Las membranas se expusieron sobre películas para rayos X. Los RNA detectados en las autorradiografías se cuantificaron por densitometría, utilizando un 300 Series Computing Densitometer, Image Quant V3.3 (Molecular Dinamics Inc, Sunnyvale, California).
Análisis estadístico
Para la respuesta proliferativa ante mitógeno y antígenos se determinó la media de los índices mitóticos de los cultivos; pacientes y controles se contrastaron por medio de la prueba de Mann Whitney. La producción de cada citoquina en los sobrenadantes también se analizó mediante la prueba de Mann Whitney, comparando la media de los valores obtenidos entre los asmáticos y controles y de las tres repeticiones de cada paciente con SHIE y controles. Para el análisis estadístico del "slot blot" en la detección del RNA específico, se utiliz ó el ANOV A no paramétrico de Kruskall-Wallis, se confrontaron las áreas de densitometría de los individuos de cada uno de los grupos de estudio.
Respuesta proliferativa frente a PHA y antígenos específicos
Para determinar la respuesta proliferativa de los linfocitos a la activación específica (antígenos) e inespecífica (mitógeno), se evaluó la incorporación de timidina tritiada en cultivos de CMSP en presencia de diferentes estímulos. La respuesta proliferativa a la PHA fue normal y no se encontró ninguna diferencia significativa entre los tres grupos estudiados. En cambio la blastogénesis de células mononucleares fue significativamente más baja en los pacientes con SHIE respecto a la respuesta de los controles, cuando las células se estimularon con toxoide tetánico (p<0.01), D. pteronyssinus (p<0.05) o C. albicans (p<0.001 en SHIE1 y p<0.05 en SHIE2). Los pacientes asmáticos respondieron de manera similar que los controles frente a los antígenos (Tabla 1).
Producción de citoquinas en sobrenadantes
Con el fin de evaluar si en los pacientes con SHIE era posible evidenciar un patrón definido de citoquinas después del estímulo de los linfocitos T, se cuantificaron los niveles de IL2, IL-4, IL-10, IFN-γ, GM-CSF y TNF-α en los sobrenadantes de los cultivos en respuesta a PHA y a antígenos específicos. En los pacientes con asma alérgica se detectó un aumento significativo (p<0.005) de la producción de IL-4 después del estímulo con PHA y disminución significativa (p<0.05) en la producción de IFN-γ con respecto al grupo control usando el mismo estímulo (Figura 1). Por su parte, en los pacientes con SHIE no se evidenciaron diferencias significativas en la producción de IL-4 e IFN-γ con respecto a los sujetos controles; sin embargo, en ellos se encontró un marcado aumento de la producción de GM-CSF con respecto al grupo control, tanto en los sobrenadantes de los cultivos sin estímulo, como en los tratados con PHA (p<0.005 SHIE 1 y p<0.05 en SHIE2), C. albicans (ρ <0.0001), D. pteronyssinus (p<0.0001) y toxoide tetánico (p<0.0001) En los pacientes con asma alérgica también se observó un aumento significativo en la producción de esta citoquina en los cultivos estimulados con PHA ( p<0.051. C. albicans (p<0.05) y toxoide tetánico (p<0.05) (Figura 2 ). No hubo diferencias significativas en las concentraciones de IL-2. TNF-α e IL-10 en los sobrenadantes al comparar los pacientes con SHIE, los asmáticos y sus respectivos controles (no se muestran datos).
Detección de RNA para IL-12p40, IL-4 e IFN-γ
Puesto que la síntesis de las proteínas y en particular de las citoquinas tiene diferentes niveles de regulación, evaluamos la expresión del RNA para diferentes citoquinas por medio de una técnica de slot-blot, con el fin de detectar posibles diferencias en la transcripción de los respectivos genes entre los pacientes y los controles. La producción de IL-4 e IFN-γ se analizó en los cultivos estimulados o no, con D. pteronyssinus. En los pacientes asmáticos se encontró un aumento significativo de la producción de RNA para IL-4 (p<0.05) (Figura 3A) y disminución significativa del RNA para IFN-γ (p<0.05) en respuesta al D. pteronyssinus (Figura 3B), mientras que los pacientes con SHIE no revelaron diferencias significativas en los niveles de RNA para ambas citoquinas. En las células obtenidas de los cultivos sin estímulo no hubo diferencias significativas en la expresión del RNA para IL-4 e IFN-γ entre los grupos analizados. Finalmente, no se encontraron diferencias significativas en la producción de RNA específico para IL-12p40 en respuesta a PHA o toxoide tetánico (datos no mostrados).
Investigamos el comportamiento funcional de los linfocitos Τ en el SHIE y en pacientes con asma alérgica, como modelos de alteración en la regulación de la síntesis de IgE. En los primeros esta alteración se acompaña de un defecto severo en la respuesta inmune ante ciertos gérmenes y por lo tanto de un cuadro de infección recurrente (1,2), mientras que en los pacientes con asma alérgica el defecto de la inmunorregulación de la IgE está restringido a ciertos alergenos y aunque no se asocia a un cuadro clínico de inmunodeficiencia, sí se propone que la producción exagerada de IgE en pacientes atópicos puede resultar de una deficiencia en la células o factores que regulan negativamente la síntesis de IgE (3, 31).
En los sujetos con asma alérgica encontramos un aumento y disminución significativos en la transcripción y síntesis de la IL-4 y el IFN-γ respectivamente, cuando las células mononucleares fueron estimuladas con PHA, lo cual establece un patrón de respuesta TH2, que predomina en las enfermedades atópicas (2,16,25). Por el contrario, en los pacientes con SHIE claramente se observó que no había diferencias en la síntesis de estas citoquinas, corroborando lo reportado por Vercelli y cols, quienes no evidenciaron ninguna diferencia en la síntesis de IL-4 o EFN-γ (10). De otro lado, no hubo diferencias significativas en la producción de IL-12, IL-10, IL-2 o TNF-α entre los dos grupos de pacientes y los controles; estas citoquinas son importantes en el establecimiento de las subpoblaciones de células TH (15, 16). De lo anterior se puede concluir que en nuestros pacientes con SHIE no existe un patrón definido de citoquinas durante la respuesta inmune ante los antígenos usados en este estudio.
El GM-CSF fue la única citoquina alterada en nuestros pacientes con el SHIE. Se observó un aumento significativo en todos los cultivos, inclusive en los cultivos sin estímulo, indicando una condición establecida in vivo. Estos niveles elevados de GMCSF pueden ser consecuencia de la recurrencia y persistencia de las infecciones que sufren estos pacientes. Sin embargo, recientemente se ha descrito que la histamina induce la síntesis de GM-CSF por parte de células mononucleares (32), y en los pacientes con SHIE hay una alta concentración de IgE antígeno específica que induce la degranulación de mastocitos y por lo tanto liber ación de histamina (2). Esta afirmación está de acuerdo con el hallazgo de que los pacientes con asma alérgica también presentaron un aumento significativo de la producción de GM-CSF en los cultivos de células mononucleares, aunque el incremento no fue tan marcado como en los pacientes con SHIE. De otro lado, en los pacientes alérgicos se ha demostrado el aumento de esta citoquina (33, 34), lo cual contribuye a la cronicidad de estas enfermedades inflamatorias por su acción sobre diversas células, pues estimula la acumulación y activación de los eosinófilos (19,22), potencia la liberación de mediadores de la inflamación (23, 24, 34, 35), y activa y aumenta la sobrevida de los macrófagos (33).
Es probable que el GM-CSF tenga efectos similares en el SHIE. La alteración de la regulación de la síntesis de IgE en las dos patologías analizadas en este estudio, es completamente diferente. En los asmáticos la hiperproducción de IgE depende de la interacción física entre células Τ y Β a través de la unión de CD40 y CD40L (36) así como del aumento de la síntesis de IL4 por las células Τ (25); por lo tanto depende básicamente de las células TH2 y las manifestaciones clínicas de estos pacientes se correlacionan con los efectos de las citoquinas secretadas por esta subpoblación (5, 37). En cambio en el SHIE se ha reportado que el aumento de la IgE es independiente de las interacciones celulares, de la IL-4 endógena y de la regulación negativa por el IFN-γ (12).
De otro lado, la disminución de la respuesta proliferativa frente a los antígenos toxoide tetánico, C. albicas y D. pteronyssinus en los pacientes con SHIE, sin alteración de la proliferación ante el estímulo con PHA es un fenómeno bastante interesante. Estos hallazgos han sido reportados en todos los pacientes con SHIE (1-3) y se correlacionan con la disminución del porcentaje de células Τ de memoria, reportado por Buckley (8). Esto puede ser consecuencia de un defecto en las señales de activación de los linfocitos Τ durante el reconocimiento antigénico o de una alteración en el procesamiento o presentación de ciertos antígenos por parte de la célula presentadora de antígeno.
De acuerdo con los hallazgos del presente estudio y lo informado en la literatura, proponemos que el defecto en el SHIE puede radicar en una falla en la activación de los linfocitos TH. que afecta el establecimiento de las células Τ de memoria, posiblemente acompañado de la falta de polarización hacia uno de los fenotipos TH1 y TH2. El defecto en la memoria se manifiesta en las infecciones recurrentes. Además, en la síntesis exagerada de IgE podría estar participando la IL-13 u otra citoquina involucrada en la modulación positiva de esta inmunoglobulina. Recientemente se ha demostrado que las células Τ CD4+, CD45R0(linfocitos Τ vírgenes) inducen eficientemente la producción de IgE vía IL-13, lo cual no fue afectado por el IFN-γ ni por anticuerpos contra la IL-4; además la inducción de la IgE pudo ser transferida con sobrenadantes de cultivos (38). El aumento en el GM-CSF y posiblemente de otras citoquinas proinflamatorias quizá es secundario a la persistencia del antígeno, debido al defecto en la activación de los linfocitos TH, y a la liberación de histamina desde los mastocitos. A su vez, este factor contribuye al daño tisular y tal vez promueve la producción de IL13 como mecanismo regulador de inflamación.
Hyperimmunoglobulinemia Ε (HIE) syndrome, which cause is unknown, is a primary immunodeficiency characterized by high levels of IgE, severe recurrent infections and defects in the immune response mediated by Τ cells. In order to evaluate the cytokine profile of mononuclear cells and its possible involvement in pathogenesis of defects with alteration of IgE regulation, we studied the in vitro behavior of some cytokines in patients with HIE syndrome, allergic asthma and normal subjects. The lymphoproliferative response of mononuclear cells upon mitogen and antigen stimulation was evaluated by H3-thymidin e incorporation . The cytokine profile of mononuclear cells isolated of these patients and cultured in presence of different stimuli was determined by ELISA of supernatants and slotblot of total RNA. Our HIE syndrome patients showed a significant increase in the production of GM-CSF in cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated or nor with tetanus toxoid, Candida albicans, Dermatophagoides pteronyssinus and PHA. No alterations were observed in the production of: IL-2, INF-γ, IL12p40, IL-4, IL-10 and TNF-α. Moreover, these patients showed an impaired lymphoproliferative response to specific antigens, whereas PHA induced a normal response. In asthmatic patients a TH2 pattern of cytokines was established in cultures of PBMC stimulated with PHA and Dermatophagoides pteronyssinus: a significant increase of IL-4 and decrease INF-γ were observed. It is suggested that the immune defect in HIE syndrome might reside in some failure in the activation of TH cells, possibly accompanied by the lack of polarization toward phenotypes TH1 and TH 2, affecting the establishment of memory Τ cells. The high levels of GM-CSF in HIE syndrome can be secondary to antigen persistence due to a defect in the activation of TH cells. GM-CSF would contribute to eosinophilia and tissue damage that accompany recurrent infections in hyperIgE patients.
Agradecemos a la profesora Fabiola Toro, al Dr. Juan E. Pérez y al biólogo Juan A. López por su ayuda técnica. Este trabajo de investigación fue posible gracias a la financiación de Colciencias y de la Vicerrectoría de Investigaciones (CODI) de la Universidad de Antioquia.
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