Martín Correa, Jorge Ossa, Miguel Builes, Mario Arbeláez
Dr. Martín R. Correa: Profesor Facultad de Medicina Universidad de Cartagena; Dres. Jorge K. Ossa, Miguel Builes y Mario Arbeláez: Profesores Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia.
Solicitud de separatas al Dr. Correa.
Basados en el papel central que ejercen el interferón gama (INF-γ) y el factor necrosante de tumores (FNT) en los procesos de activación e inf lamación y en los efectos antivirales de éstos, nos propusimos determinar sus niveles en cultivos mixtos de linfocitos (CML) de parejas de candidatos receptores/donadores de trasplante renal. Mediante rad ioinmunoaná lisis y ensayo biológ ico correlacionamos estos niveles con la presencia de ep isod ios de rechazo e infección por citomegalovirus (CMV) en el período postrasplante.
Las citoquinas comprenden una amplia clase de proteínas celulares que controlan la amplitud y duración de la respuesta inmune. Se caracterizan porque a menudo son glicosiladas, y por bajo peso molecular (80 kd); ejercen su efecto en forma paracrina o autocrina en el microambiente donde se producen, interactúan con receptores de superficie celular y regulan la transcripción de un sinnúmero de genes por mecanismos de segundos mensajeros poco comprendidos.
El número de citoquinas ha aumentado en forma considerable en los últimos años y consecuentemente la nomenclatura de estos factores se ha hecho más compleja. Se dividen en monoquinaso linfoquinas, según la célula productora principal (monocitos o linfocitos, respectivamente); el término interleuquina se reserva para aquellascitoquinas cuyos genes y estructura proteica ya han sido determinadas (1).
El interferón gama (IFN-γ) es una interleuquina de composición glicoproteíca, que es secretada por los linfocitos T, principalmente, luego de la inducción por un estímulo antigénico o mitogénico. El IFN-γ pertenece al grupo de interferones descubiertos inicialmente por su efecto antiviral. Existe también el interferón α y β que son producidos, principalmente, por macrófagos yfibroblastos, respectivamente.
Además de su actividad antiviral, el IFN-γ ejerce una plétora de efectos biológicos que incluyen diversas actividades inmunomoduladoras: es un elemento esencial en la activación de macrófagos, es un poderoso inductor de antígenosde superficie, principalmente antígenos clase IIdel complejo mayor de histocompatibilidad yaparentemente cumple también un papel importante en la producción de anticuerpos (1-3).
El factor necrosante de tumores (FNT)/caquectina es una proteína liberada por los macrófagosactivados, en respuesta principalmente a estimulación por endotoxina. Esta sustancia fue originalmente descrita en el suero de ratones inoculados con bacilos de calmette-guerin y endotoxina bacteriana; su característico efecto in vivo es la producción de necrosis de tumores. La similitud biológica y funcional de esta molécula con la caquectina, descubierta en conejos infectados contripanosoma y responsable de la caquexia, llevó a la conclusión de que se trataba de una misma sustancia, mediadora de diferentes efectos biológicos. Además de la endotoxina se ha demostradoque otros agentes tienen la capacidad o propiedadde inducir esta citoquina, entre los cuales se encuentran ciertas partículas virales (1, 4-6).
Es importante decir que el FNT comparte numerosas actividades biológicas con la interleuquina1 (propiedades inflamatorias, efectos en el endotelio vascular, adhesión de leucocitos, activación de linfocitos), pero tienen diferentes receptores celulares. Hay considerable evidencia quelos efectos inducidos in vitro también ocurren in vivo y pueden jugar papeles importantes en la evolución de la respuesta inflamatoria y en la injuria vascular. El FNT producido por los macrófagos es también denominado FNT-α para distinguirlo de la linfotoxina (LT), producto linfocitario estrechamente relacionado, al cual se le llama FNT-β. Los linfocitos además de producir FNT-β producen FNT-α, al ser estimulados con ésteres de forbol simultáneamente con un ionóforo de calcio como A23187; sin embargo en los macrófagos sólo se ha detectado producción de FNT-α (1,4-7).
Los genes de la LT y el FNT/caquectina seencuentran en el complejo mayor de histocompatibilidad en el cromosoma seis humano, separados por cerca de 1100 pb. A pesar de la limitada homología genética, la LT ejerce un rango de actividades biológicas que son concordantescon las de FNT/caquectina, tanto in vivo como in vitro.
El FNT/caquectina tiene diversos efectos biológicos que comprenden: muerte de células tumorales in vitro, regresión de tumores in vivo,inhibición de actividad de proteína lipasa (actividad de caquectina), mediador de algunos de los efectos letales de la endotoxina en animales, estimulación de granulocitos y aumento de su adhesividad, daño a las células endoteliales, resorción ósea, actividad antiviral y efectos citotóxicos contra parásitos de la malaria (4-6).
El IFN-γ también aumenta la producción de FNT y sensibiliza las células al FNT porque incrementa la expresión de receptores para esta citoquina (2).
La reacción de rechazo y la infección por citomegalovirus (CMV) son las dos principalesdificultades en el área de los trasplantes. Y el mayor agente infeccioso en este grupo es el CMV,denominado "el gnomo de los trasplantes".
El rechazo de los trasplantes y la infección porCMV son fenómenos estrechamente relacionados entre sí y dependientes ambos del grado de histocompatibilidad entre donador y receptor y dela inmunosupresión terapéutica (8).
El propósito del presente trabajo fue hacer unaprimera aproximación a la posibilidad de utilizar estas sustancias como predictores del éxito del trasplante renal en el marco de nuestros estudiosrelacionados con CMV y trasplante.
En estudios tendientes a lograr la reactivación del CMV in vitro en trasplantados (9), decidimos med ir los nive les de estas linfoquinas ycorrelacionar estos niveles con la presencia de episodios de rechazo e infección por CMV en elperíodo postrasplante.
Se estudiaron candidatos a trasplante renal ysus respectivos donadores, apareados por el grupode Trasplantes del Hospital Universitario San Vicente de Paúl (HUSVP). A estas parejas se leshizo estudio serológico para CMV y se les practicóCML pretrasplante, en el momento de la determinación de anticuerpos citotóxicos (una a dos semanas antes del trasplante). Los cultivos se incubaron por cinco días, con adición de 3H-timidina para obtener resultados de proliferación; simultáneamente se hicieron CML en idénticas condiciones, excepto la adición de timidina. El sobrenadante de los CML se congeló a 70 grados C, a las 24horas para la medición del FNT, y a los cinco días para IFN-γ.
Los pacientes trasplantados fueron estudiados clínicamente por el grupo de trasplantes duranteun año y cuando se presentó un síndrome febril, sepracticó análisis citológico en orina en búsquedade células de inclusión compatible con CMV.
También se utilizaron combinaciones de individuos normales histocompatibles (haploidénticos) para determinar la cinética de producción de estos factores in vitro.
Bioensayo en células L-929
Se utilizó la prueba biológica con células L929 susceptibles a FNT/LT (10), en la siguiente forma: se sembraron 0.2 ml con 2 x 104 células L929 en RPMI-1640 (Difco) + 5% SBF en platos estériles de 96 pozos (Nunc) fondo plano y se incubaron por 24 horas a 37 grados C en cámara humidificada. Posteriormente se tomaron los sobrenadantes de los CML, se hicieron diluciones dobles en RPMI-1640 (con actinomicina D, lug/ ml), se sembró cada dilución (200 ul de volumen final) por cuadriplicado sobre la monocapa de células L-929 y se rcincubó por 20 horas.
Luego se adicionaron 50 ul de solución de rojo neutro (0.033% en PBS p/v), se incubó por una hora, se removió el medio y se lavó dos veces con 200 ul de PBS a 37 grados C. Posteriormente se lisaron las células con 200 ul de la mezcla 50% v/ v de etanol y 0.1 M de fosfato sódico monobásico. La lectura de la absorbancia se realizó en un microlector de ELISA a 550 nm.
El título resulta de la más alta dilución de la muestra que cause 50% de citotoxicidad comparado con el control de células (100%). Esta técnica detecta la actividad conjunta de FNT y LT sin distinguir entre uno y otro.
Radioinmunoensayo (RIA)
Por este método se determinaron el IFN-γ y el FNT-α.
El sistema RIA (IFN-γ o FNT-α) es un radioinmunoensayo de fase sólida en una configuración de "emparedado". Las esferas de poliestireno cubiertas con anticuerpo de ratón, monoclonal específico, para IFN-γ o FNT-α humano, son incubadas con los especímenes y con los estándares apropiados. El anticuerpo trazador específico que reconoce un epítope diferente al monoclonal inicial, está marcado con 1125.
Se generó una curva estándar (concentración de IFN-γ u/ml o FNT-α pg/ml) contra la radiactividad específica (cpm), determinada en un contador gama.
Se probaron las muestras de sobrenadantes de CML, siguiendo las instrucciones del laboratorio productor (Centocor, Great Valley Parkway).
Análisis estadístico
Se calcularon las medias aritméticas y se utilizó ANOVA para establecer diferencias entre pacientes con rechazo e infección por CMV y pacientes sin rechazo.
En dos pruebas diferentes para la determinación de IFN-γ y FNT, la curva de controles estándar arrojó un coeficiente de correlación de 0.99.
Se analizó la cinética de producción de FNT-α e IFN-γ en el CML mediante el RIA entre dos individuos normales (Tabla 1). Los mayores niveles del FNT-α se pudieron detectar a las 24 horas,desapareciendo progresivamente en los días subsiguientes. Por su parte el IFN-α presentó niveles mínimos a las 24 horas y mayores a las 120 horas (quinto día).
Tabla 1. Cinética de producción de factor nécrosante de
tumores (FNT) e interferon gama (IFN-Gama) en el cultivo
mixto de linfocitos.
En los sobrenadantes de CML de las 12 parejasestudiadas (receptor/donador) (AxB*), se obtuvoun promedio de IFN-γ mayor (9 u/ml) en los pacientes que presentaron rechazo al comparar conaquellos que no presentaron rechazo (5.8 u/ml)(Tabla 2). De igual forma el promedio de los niveles de IFN-γ en los pacientes que presentaronenfermedad por CMV fue más elevado (5.8 u/ml) (Tabla 2). Sin embargo en ninguno de los dos casos las diferencias fueron estadísticamente significativas.
Tabla 2. Determinación de niveles de interferón gama en
sobrenadantes de cultivos mixtos de linfocitos entre receptor/
donador de trasplante renal (AxB*) y relación con rechazo,
infección por citomegalovirus y linfoproliferación (XRR).
En ocho parejas se pudieron obtener resultados de la reactividad del receptor contra la mezcla de células de personas no relacionadas; como lo muestra la Tabla 3 se encontró que la producciónde IFN-γ es también mayor en los pacientes quepresentaron rechazo (23.6 u/ml), que en aquellosque no lo presentaron (12.5 u/ml). Igualmente, enlos pacientes que sufrieron enfermedad por CMVfueron más elevados los niveles promedio de IFNγ (25 u/ml) que en los pacientes que no la presentaron (13.6 u/ml). Tampoco, en este caso se encontraron diferencias estadísticamente significativas.
Tabla 3. Determinación de niveles de interferón gama en
sobrenadantes de cultivos mixtos de linfocitos de candidatos
de trasplante renal (A x P*) y relación con rechazo, infección
por citomegalovirus y linfoproliferación (% RR).
En células L-929 se sembraron 56 muestras de sobrenadantes de CML por cuadriplicado, pero nose detectó ningún efecto sobre este sistema.
A pesar de que los progresos en el área de latipificación HLA han hecho posible el avance delos trasplantes de órganos, el rechazo sigue siendola mayor limitante de la eficiencia de este procedimiento. Para afinar la tipificación se dispone enla actualidad del análisis de fragmentos longitudinales de restricción (RFLP) y más novedoso aún, la amplificación de los genes específicos mediante "indicadores" conocidos por la reacción de polimerasa en cadena (PCR). A pesar de lo anterior, sería importante disponer también de pruebas funcionales como la producción de citoquinas que son al fin y al cabo los factores que van a modular la respuesta (11, 12).
En este estudio se intentó correlacionar los niveles de interferón gama con la presentación de rechazo, de enfermedad por CMV, grado de compatibilidad HLA (A+B,DR) y respuesta proliferativa (CPM y %RR), pero dada la amplia variabilidad de la respuesta entre los pacientes no se pudo determinar ninguna diferencia estadística significativa.
Los pacientes que presentaron episodios de rechazo produjeron mayores niveles de IFN-γ tanto en respuesta a su donador, como frente a la mezcla de personas no relacionadas. En la misma forma, aquellos pacientes que presentaron enfermedad de CMV, presentaron mayores concentraciones de IFN-γ en las dos condiciones analizadas.
La infección por CMV in vitro produce incremento en la expresión de antígenos HLA de clase I y β2-microglobulina, pero no induce el aumento de antígenos de clases II. Sin embargo, si se agrega IFN-γ a las células infectadas, se encuentra que la infección viral no inhibe la expresión de clase II inducida por la linfoquina. Esto concuerda con los hallazgos y postulados de Von Willebrand, relacionados con una mayor expresión de antígenos de clase II en los pacientes infectados por CMV; esto se daría por la simultaneidad de la infección y la producción de IFN-γ y podría ser el evento central de la asociación patogénica entre CMV y rechazo (13-18). Adicionalmente, en relación con la patogénesis del rechazo y la infección, se ha demostrado que la expresión de antígenos de histocompatibilidad por el injerto es requisito indispensable pero no suficiente para la reacción de rechazo (15).
La determinación seriada de algunas citoquinas en el curso de un trasplante renal para ayudar al diagnóstico precoz del rechazo ha sido desalentadora (19-21); sin embargo, las posibilidades de utilizarlas como pruebas pronósticas no se han agotado. Conjuntamente con otras variables como HLA, serología para CMV, edad, relación con el donador, y %RR, podría eventualmente formarse un algoritmo para la predicción del éxito del trasplante.
Si la significancia estadística de las tendencias observadas en este trabajo se llegara a demostrar, podríamos elucubrar sobre si la potencialidad de sufrir un rechazo es innata y que constitutivamente el individuo que rechaza sería un alto productor de citoquinas. La aplicación práctica inmediata sería la medición de niveles de IFN-γ como prueba predictiva y para ajustar el esquema inmunosupresor en cada situación.
Sería importante, debido a los altos costos del RIA y teniendo en cuenta la importancia del FNT/ LT en la reacción alogénica, en la replicación de algunos retrovirus y en la reacción con el IFN-γ (22-24), tratar de aumentar la sensibilidad de la prueba biológica con células L-929 y recurrir también a la prueba biológica del INF. Finalmente, basados en el impacto científico y la trascendencia clínica de pruebas predictivas para el éxito del trasplante, sugerimos la necesidad de continuar esta línea de investigación.
This study reports the levels of Tumor Necrosis Factor (TNF) and Gamma Interferon (INF-γ)produced in Mixed Lymphocyte Cultures (MLC) from recipient and donor of kidney transplants. The cytokines were tested by radioimmunoassay; the TNF was also measured by using a biologic test with L-929 cells. The results were correlated with HLA typing, alloproliferation, rejection episodes and incidence of Clinical Cytomegalovirus (CMV) infection. In those couples with rejection there was a non statistically significant tendency to produce greater concentrations of both TNF and INF-γ; this finding was also true for those that developed CMV infection. If these non significant tendencies become significant in further studies, they could open new prospectives to the study and therapeutic approach of rejection.
A Colcicncias por su aporte económico a través del proyecto 1115-05-088-85.
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