M.E. Giraldo, D. García de Olarte
María E. Giraldo: Estudiante de Biología; Dra. Diana García de Olarte: Profesora Titular Sección de Inmunología; Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín.
Solicitud de separatas a la Dra. Giraldo.
La estandarización de técnicas que permitan el análisis nuclear de los polimorfonucleares neutrófilos es importante para determinar, en un momento dado, la capacidad de defensa de un individuo. Uno de los parámetros susceptibles de medición y que se correlaciona positivamente con la capacidad funcional del polimorfonuclear, es la producción de agentes oxidantes. Específicamente, el anión superóxido es una especie reactiva del oxígeno que se genera durante la explosión respiratoria y sirve como medida de la misma. El anión superóxido puede ser determinado a través de una reacción colorimétrica que utiliza el citocromo C como substrato. Este trabajo presenta los resultados de la estandarización de un nuevo método para la detección del anión superóxido con el cual se ahorran significativamnete tiempo, reactivos y células. Con esta prueba encontramos, en 26 individuos normales, que no hay diferencias en la producción del anión superóxido en los grupos por edades ni por sexo y el promedio de valores para las células en reposo y para las células estimuladas fue de 0.81 ± 0.53 y 12.28±0.87 nanomoles/106 polimorfonucleares/30 minutos, respectivamente.
Durante la explosión respiratoria de los polimorfonucleares neutrófilos se presenta una estimulación del ciclo de las pentosas y un gran incremento en el consumo de oxígeno que es empleado principalmente para formar anión superóxido. La exposición de los polimorfonucleares neutrófilos a estímulos particulados (1) o solubles (2, 3), induce una activación de su metabolismo oxidativo (4), produciendo y liberando extracelularmente especies reactivas de oxígeno, como anión superóxido (O2-.), peróxido de hidrógeno (H2O2), radicales hidroxilo (OH—OH.) y oxígeno simple, las cuales juegan un papel importante en la actividad bactericida (5, 6,7).
Ya que el anión superóxido es el producto primario de la explosión respiratoria de los polimorfonucleares, su cuantificación permite hacer un análisis funcional de esta actividad metabólica. Un método utilizado es la reducción del ferricitocromo C (1, 8, 9), el cual requiere de una gran inversión de tiempo, reactivos y células, lo que hace difícil su empleo en el laboratorio. Se presenta en este informe la modificación de la técnica de Babior y colaboradores (1), haciéndola más ágil y económica.
En la estandarización de este método se tomaron polimorfonucleares neutrófilos (PMN) extraídos de individuos normales con los cuales se llevaron a cabo una serie de experimentos por duplicado, para determinar las concentraciones de los reactivos citocromo C, superóxido dismutasa (SOD), el tiempo de incubación y el efecto de la preincubación de las células con mezcla de sueros humanos.
Una vez establecidas las condiciones apropiadas de la técni ca, se efectuaron ensayos para probar si existían diferencias en la producción de anión superóxido en estado de reposo y de estímulo con PMA, entre los sexos y entre grupos de edad. Para ello se estudiaron veintiséis (26) individuos normales, que se distribuyeron en dos grupos. El primero se configuró con nueve mujeres entre 24 y 31 años y seis hombres entre 22 y 27 años. El segundo grupo por nueve y once mujeres entre los 24 y 31 años y los 46 y 58 respectivamente (Tabla 1).
Tabla 1. Distribución de grupos por edades
Separación de las células. Los polimorfonucleares neutrófílos se obtuvieron de sangre periférica heparinizada (10 unidades/ml). Los eritrocitos se sedimentaron con dextrán al 6% por una hora. El plasma rico en leucocitos se sometió a centrifugación en gradiente de densidad (Lymphocyte separatium médium, LSM, Litton Bionetics, Kensington, MD). Los glóbulos rojos contaminantes fueron removidos por medio de lisis hipotónica y las células se lavaron con solución de Hank's (HBSS, Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) suplementada con gelatina (Difco Laboratories, Detroit, MI) al 0.1% y se resuspendieron en PBS, pH 7.4, a una concentración de 6.66 x 106 PMN/ ml, con una viabilidad mayor del 97% (medida por la exclusión del azul de tripano) y una pureza mayor del 95% (medida con violeta de genciana).
Determinación de la reducción del citocromo C dependiente de anión superóxido. En tubos de poliestireno de 12 x 75 mm (Fischer Scientific, Pittsburgh, P.A.) se prepararon cuatro reacciones por duplicado. Cada tubo con un volumen final de 1.0 ml contenía: 330 μl de una solución de citocromo C (Cytochrome C Type VI, Sigma Chemical Co„ St. Louis, MO.) 0.2 mM, PBS pH 7.4 en la cantidad necesaria para ajustar el volumen y 2 x 106 PMN/ ml. Estas células habían sido preincubadas con 10% de una mezla de sueros humanos por 10 minutos a 37oC, en baño de María con agitación. Las células en cuatro de los tubos fueron estimuladas agregando 100 μl de una solución de PMA (12-0 Tetradecanoyl-Phorbol13-Acetate, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) de 50 μgr/ml.
La especificidad de la reacción se aseguró adicionando 160 μl de SOD (Superoxide dismutase, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) 0.2 mgr/ml a dos de los tubos estimulados y a dos sin estímulo (reposo). En el momento cero de la reacción se tomaron 0.5 ml de cada tubo y se colocaron en hielo para utilizarlos como blancos en la lectura espectrofotométrica. Los restantes 0.5 ml se incubaron a 37°C por 30 minutos en baño de María con agitación, luego se paró la reacción colocando los tubos en hielo. Finalmente las células se removieron de los tubos blancos y experimentalmente centrifugando a 1500 x g por 10 minutos a 4oC.
Lectura. La absorbancia se determinó en un microlcctor de ELISA (Dynatech, Minireader II) utilizando un filtro de 550 nm (10), colocando 150 μl de cada uno de los sobrenadantes en los pozos del microplato (Cooke microtiter, Dynatech Laboratories Inc, Virginia). Los cambios en la absorbancia entre los tubos con y sin SOD, tanto para las células en reposo como para las estimuladas, se convirtieron a nanomoles de citocromo C reducido por 1 x 106 PMN en 30 minutos de incubación.
Se utilizó un coeficiente de extinción de E550 nm = 2.1xl04M-1CM-1 (11), un volumen de 500 μl y un longitud de la trayectoria de la luz de 0.5 cm. Se obtuvo la siguiente expresión:
tanto entre sexos como entre diferentes grupos de edad, se realizaron por la prueba de la distribución t de Student no pareada.
La reducción del citocromo C por el anión superóxido generado por los PMN en estado de reposo (nivel basal) y en estímulo, es empleada como una medida de la actividad metabólica de la célula. En esta estandarización se emplearon 106 PMN que fueron estimulados con 5 ugr/ml de PMA y con un volumen final de reacción de 0.5 ml.
En la Tabla 2 se muestran los resultados de los experimentos realizados empleando diferentes concentraciones de citocromo C: 0.1 y 0.45 mM y de SOD: 0.1 y 0.625 mgr/ml, con un tiempo de incubación de 60 minutos. Los valores obtenidos fueron: para las células en reposo 1.02 ± 0.84 y 1.95 ± 1.23 y para el estímulo 4.15 ± 1.61 y 16.58 ± 1.41 nanomoles de citocromo C reducido/106 PMN.
Tabla 2. Efecto de las concentraciones de Cit C SOD sobre la reducción de citocromo C
Con concentraciones de citocromo C 0.1 mM y SOD 0.1 mgr/ml, se llevaron a cabo experimentos de incubación de 60 y 30 minutos. Se encontraron unos valores para el estado de reposo de 1.02 ± 0.84 y 0.421 ±0.3; para el estímulo 4.15 ± 1.61 y 3.74 ± 0.6 nanomoles de citocromo C reducido/ 106 PMN, respectivamente (Tabla 3).
Tabla 3. Efecto del tiempo de incubción sobre l reducción del citocromo C
Empleando PMN que eran previamente incubados con 10% de mezcla de sueros humanos a 37°C por 10 minutos, concentraciones de citocromo C de 0.1 y 0.2 mM y de SOD 0.1 y 0.2 mgr/ ml y un tiempo de incubación de 30 minutos, se hallaron unos valores para el reposo de 0.459 ± 0.33 y 0.81±0.53y pr el estímulo de5 5.68±0546 y 12.28±0.87nnomoles de citrocromo C reducido/106 PMN(tabla 4).
Tabla 4. Efecto de la preincubación de los PMN con mezcla de sueros humanosn sobre la reduccion de citocromo C
Con base en los experimentos anteriores, se eligieron las condiciones de citocromo C de 0.2 mM, SOD 0.2 mgr/ml, tiempo de incubación de 30 minutos y PMN preincubados con 10% de mezcla de sueros humanos, con los que se realizaron los ensayos para determinar las posibles diferencias entre los sexos y entre los grupos de edades.
En la Tabla 5 se presentan los valores de la producción de anión superóxido para las células en reposo y estimuladas, en hombres y mujeres. No se observaron diferencias significativas entre ellos (P = 0.1037 y Ρ = 0.29, respectivamente). La Tabla 6 muestra los valores por grupos de edades. Tampoco se encontraron diferencias significativas entre ellos (P = 0.3365 y Ρ = 0.3689).
Tabla 5. Comparación de la reducción del citocromo C entre sexos
La actividad microbicida de los PMN involucra varios fenómenos entre los cuales está la explosión respiratoria que puede medirse independientemente del proceso de la fagocitosis (ingestión) Anión superóxido en polimorfonucleares mediante la estimulación con PMA a través de la proteína kinasa C (12,13, 14), generándose anión superóxido el cual puede ser cuantifícado a través de la reducción del citocromo C. Estas células fagocíticas así estimuladas, alcanzan tasas de efectividad metabólica iguales o mayores que las obtenidas con estímulos particulados (3, 12).
El método informado en este trabajo es una modificación de la técnica de Babior y col (1) y posee sobre este y otros métodos reportados (8,9), dos ventajas principales: la primera, una reducción en el número de células y en el volumen final de la reacción, lo que implica una economía en los reactivos; y la segunda, una disminución en la complejidad del proceso de la lectura, lo que hace posible realizar múltiples determinaciones en menor tiempo. Este método a diferencia del de Babior y col y a semejanza de otros (15,16) utiliza una mezcla de sueros humanos con el objeto de lograr respuestas mayores lo cual facilita el tratamiento estadístico de la información. El mecanismo mediante el cual el suero tiene un efecto en esta reacción no ha sido caracterizado pero se supone que no interfiere con los resultados puesto que el PMA activa la proteína kinasa C y no otros receptores relacionados con el complemento o las inmunoglobulinas.
Analizando la reducción del citocromo C obtenida para las células en reposo y para las estimuladas, no se encontraron diferencias entre los sexos y las edades (Tablas 5, 6). Para los individuos estudiados con edades entre 38.04 ± 13.67 años, se obtuvieron unos valores tanto para las células en reposo 0.81 ± 0.53 como para las estimuladas 12.28 ± 0.87 nanomoles de citocromo C reducidos por 106 PMN en 30 minutos. El incremento en el metabolismo fue de 15.13 veces, lo que garantiza un índice de estimulación que permite hacer correlaciones cuando se estudian PMN con deficiencias. El análisis de las células en estado de reposo presenta coeficientes de variación elevados, lo que podría estar significando un comportamiento funcional muy disperso (Figura 1).
Tabla 6. Comparación de la reducción del citocromo C en grupos de eddes
Figura 1. Reducción del citocromo C.Reposo y estímulo
Standardization of techniques allowing functional analysis of neutrophils is important in order to assess defense capabilities of an individual at given time. One of the parameters which is messurable and correlates positively with neutrophils functional activity is the production of oxidative agents by these cells. Specifically the superoxide anión is a reactive species of oxigen which is generated during the Respiratory Burst and serves to measure it. The superoxide anión can be estimated by a colorimetric reaction which uses cytochrome C as substrate. This paper reports the results of standardization of a new method for detecting superoxide anión. This method significantly saves time, reagents and cells. By using this technique we found no sex or age related differences in the production of superoxide anión. The average valúes for cells at rest and stimulated cells was 0.81 ± 0.53 and 12.28+ 0.87 nanomoles/106 PMN/ 30 minutes, respectively.
Agradecemos a los doctores John Jairo Estrada, Francisco J. Gómez y Jorge Ossa, por su valiosa colaboración en la realización de esta publicación.
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